免疫检验点激动剂抗体的Cross-linking
近年来，PD-1/PD-L1引领的肿瘤免疫全面兴起，免疫检验点成为竞争焦点。共抑制信号的免疫检验点抑制剂抗体进展相对顺利，激动剂抗体则出现较多的波折。其中很重要的问题就是其激活机制复杂，Cross-linking对于其激动剂活性影响很大。典型的TNFR超家族受体与配体的结合通常依赖于配体的三聚体形式，如OX40、CD40、4-1BB、DR5/DR4、GITR等。随着机理渐渐清理，一些相对成熟的技术平台或将成为解决cross-linking更好激活这些靶受体的方法。简单说可以概括为以下几类：
提高FcγRIIb受体的亲和力，但需注意不能影响其他FcγR受体的亲和力以避免影响ADCC活性等；
多价抗体，如Inhibrx开发的DR5四价纳米抗体，INBRX-109，四价抗体相对二价抗体可以更好的使受体寡聚化，更好的激活DR5。信达生物OX40四价抗体为类似原理；
三聚体天然配体，如三叶草生物构建OX40L三聚体、TRAIL三聚体、4-1BBL三聚体等模拟天然配体的激活效应。罗氏则构建了FAP/4-1BBL三聚体（双抗形式），依赖于FAP的结合激活4-1BB；
多聚体抗体，如Genmab开发了Hexabody（E345R突变，结合靶受体后形成六聚体IgG）和IgM Biosciences的IgM亚型抗体（五聚体）。多聚体抗体可以同时结合12个或10个靶受体，更有效激活靶受体；
个别单抗的激动剂活性不依赖于Cross-linking，如信达生物的OX40抗体IBI101。
DR5靶点、DR4靶点
TRAIL-DR通路中，与TRAIL配体结合亲和力最高的是DR5（TRAIL-R2），DR4（TRAIL-R1）相对弱。早年研发DR4抗体的基本都失败了，近年来多开发TRAIL重组蛋白或者DR5抗体。最早有效激活DR5的是诺华/ablynx开发的四价纳米抗体TAS266，即通过多价抗体更好的激活DR5。不过TAS266因肝毒性较强而终止临床研究。
Inhibrx在TAS266基础上研究发现，其免疫原性强且血浆中含有较强pre-existing ADA，导致过度交联。Inhibrx认为这种ADA引起的过度交联是引起肝毒性的主要原因，因此开发了免疫原性弱、无Pre-existing ADA的四价纳米抗体INBRX-109。该药物被奕安济世引进国内，研发代码为JCT-205。
IgM Biosciences和Genmab分别开发了五聚体IgM、六聚体IgG的DR5多聚体抗体，更好的激活DR5而不再依赖于FcγRIIb-dependent cross-linking。
IgM亚型是天然五聚体形式，因此为10价抗体。IgM的一项重要特征是补体CDC活性极强，另一项特征价态高可以引发受体寡聚化在TNFR超家族受体的激活中发挥重要作用。
以下是IgM亚型DR5抗体IGM-8444的作用机制。
Genmab的Hexabody在Fc引入E345R突变，该突变使得IgG在结合抗原后Fc相互作用形成六聚体。Genmab最初的设计也是为了强CDC活性，同样的，高价态使得其在受体寡聚化中发挥重要作用。Genmab的GEN-1029还特殊在用了两个靶向DR5不同表位的Hexabody抗体，即混合物。
三叶草生物则直接构建三聚体TRAIL配体蛋白SCB-808，这也是其核心技术。
罗氏构建FAP/DR5双抗RG7386提高对肿瘤组织的特异性（FAP为肿瘤特异性靶标）。RG7386同时去除了FcγRIIb-dependent cross-linking以避免出现肝毒性，该双抗更多是依赖于FAP的结合激活DR5，但看设计可能激动剂活性不高。
复宏汉霖的HLX56为DR4抗体，具有Cross-linking效应。不过为何舍DR5而重归DR4，目前还不清楚其有什么新的生物学基础。
OX40靶点
强生2016年在JBC发表文章，将Hexabody技术应用于开发OX40激动剂抗体。S267E/L328F突变可以增强FcγRIIb亲和力，增强Cross-linking，但该突变同时也减弱了ADCC效应等。因而强生尝试用Hexabody来驱动受体寡聚化，更好的激活OX40。实验表明，E345R突变（Hexabody）可以明显增强OX40抗体的激动剂活性。
Hexabody可以有效保留ADCC、ADCP、CDC活性。
信达生物首个OX40抗体IBI101，意外地，其激动剂活性不依赖于FcγR-dependent cross-linking效应。
但要注意的是，信达生物同时开发了四价OX40抗体以更好的激活OX40。此外，三叶草生物同样开发了OX40L三聚体蛋白SCB-340。
IgM Biosciences同样开发了IgM亚型的OX40和GITR抗体。
CD40靶点
2017年百时美施贵宝在Cancer Cell上发表文章，证明CD40抗体的激动剂活性需要FcγRIIb依赖的Cross-linking。
4-1BB靶点
2020年1月，艾伯维在MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS上发表文章，发现表位和FcγRIIb依赖的Cross-linking是决定4-1BB抗体激动剂活性和降低肝毒性和关键因素。虽然对于肝毒性的影响似乎与其他研究不同，但对于激动剂的活性无疑是又一例证。
罗氏构建了双抗形式的FAP/4-1BBL，其中一侧为抗FAP抗体，另一侧融合三聚体4-1BBL（这部分类似于天然配体形式，三叶草生物也是类似方式）。4-1BBL对4-1BB的激活依赖于靶抗原（FAP）结合引发的cluster，而不再需要FcγR-dependent cross-linking。类似原理也出现在一系列PD-L1/4-1BB双抗中，如基石药业引进的ND021、科望生物引进的Inbrx-105、维立志博等。
还有一种方式是中外制药采用低亲和力的4-1BB抗体构建的4-1BB/TAA共刺激双抗，避免出现毒性。所谓共刺激双抗，4-1BB/TAA双抗本身抗肿瘤效应很弱，主要是作为与CD3/TAA双抗联用。即CD3抗体、低亲和力4-1BB抗体两重信号激活T细胞，TAA解决靶向和特异性问题。有点类似于CAR-T。
再生元也设计了类似的CD28/TAA共刺激双抗，与CD3/TAA双抗联用。
赛诺菲三特异性抗体CD3/CD28/CD38与之类似，只是将两重信号CD3、CD28整合到一个三特异性抗体分子中。
小编总结
Cross-linking背后是生物体内进化出的信号通路进化出的寡聚体（尤其三聚体，在TNFR受体超家族最常见）形式。随着机制的日渐清晰，多价抗体、FcγRIIb高亲和力抗体、多聚体抗体（IgM、Hexabody）、双抗（依赖于另一个靶点结合后再激活）等技术成为从不同角度解决交联问题的有力武器。
参考资料
Targeting the antibody checkpoints to enhance cancer immunotherapy–focus on FcγRIIB（2019）；
Fc Engineering Approaches to Enhance the Agonism and Effector Functions of an Anti-OX40 Antibody（2016）；
Interaction with FcgRIIB Is Critical for the Agonistic Activity of anti-CD40 antibody(2019)；
Rationale for anti-CD137 cancer immunotherapy（2016）；
Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy（2016）；
The Therapeutic CD38 Monoclonal Antibody Daratumumab Induces Programmed Cell Death via Fcγ Receptor–Mediated Cross-Linking（2016）；
Therapeutic activity of agonistic, human anti-CD40(2017)；
Tumor-targeted 4-1BB agonists for combination with T cell bispecific antibodies as off-the-shelf therapy(2019)；
Higher-Order Clustering of the Transmembrane Anchor of DR5 Drives Signaling（2019）；
Exploring the TRAILs less travelled=TRAIL in cancer biology and therapy(2017)。
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